ایمونوگلوبولین‌ها پروتئین‌هایی هستند که توسط سیستم ایمنی بدن تولید می‌شوند تا مواد خارجی را در بدن تشخیص دهند، به آن متصل شوند و آنها را خنثی کنند. آزمایشات ایمنی آزمایشاتی است که براساس اتصال بسیار خاص بین ایمونوگلوبولین (آنتی‌بادی نامیده می‌شود) و ماده‌ای است که به‌طور خاص تشخیص داده می‌شود (مولکول خارجی آنتی‌ژن نامیده می‌شود). آزمایش‌های ایمنی برای آزمایش یک آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن خاص در خون یا سایر مایعات مورد استفاده قرار می‌گیرد.

آزمایش‌های ایمنی برای تست وجود آنتی‌بادی در نمونه خون یا مایع شامل آنتی‌ژن خاص به‌عنوان بخشی از سیستم تشخیص است. اگر آنتی‌بادی که برای آن آزمایش می‌شود در نمونه وجود داشته باشد، به آنتی‌ژن در تست سیستم متصل و به آن واکنش نشان می‌دهد و به‌عنوان مثبت شناسایی می‌شود. اگر واکنش قابل‌توجهی نداشته باشد، آزمایش نمونه منفی است. نمونه‌هایی از آزمایش‌های ایمنی برای آنتی‌بادی شامل عامل روماتوئید (آزمایش‌هایی که برای وجود آنتی‌بادی‌های خودایمنی انجام می‌شود؛ آنتی‌بادی‌هایی که در بیماران مبتلا به آرتریت روماتوئید مشاهده می‌شود)، ویروس غرب نیل (آزمایش‌ آنتی‌بادی‌هایی که شخص در پاسخ به عفونت با آن ویروس ایجاد می‌کند) یا آنتی‌بادی ساخته شده در واکنش به واکسیناسیون (مانند آزمایشات آنتی‌بادی‌های هپاتیت B برای اطمینان از موفقیت واکسیناسیون) است.

هنگامی که از آزمایش‌های ایمنی برای آزمایش وجود آنتی‌ژن‌ها در نمونه خون یا مایع استفاده می‌شود، آزمایش شامل آنتی‌بادی‌هایی است که مورد توجه آنتی‌ژن قرار دارند. واکنش آنتی‌ژن موجود در نمونه شخص به آنتی‌بادی خاص با واکنش‌های غلظت شناخته‌شده و مقادیر گزارش‌شده آنتی‌ژن مقایسه می‌شود. نمونه‌هایی از آزمایش‌های ایمنی آزمایش برای آنتی‌ژن‌ها شامل سطوح دارویی (مثل دیگوکسین، وانکومایسین)، سطوح هورمون (مثل انسولین، TSH، استروژن) و مارکرهای سرطانی (مانند PSA، CA-125 و AFP) هستند.

منابع
(© 2006). Immunoassay Detection Technologies, Chapter 2. Abbott Diagnostics Scientific Resources Learning Guide [On-line information]. PDF available for download through http://www.abbottdiagnostics.com.

Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Harris, N. and Winter, W. Chapter 10, Immunoassays. Pp. 117-119.

این روش آزمایش یک نوع آزمایش ایمنی است. بر پایه این اصل است که آنتی‌بادی‌ها به آنتی‌ژن‌های بسیار خاص متصل می‌شوند تا تجمع‌های آنتی‌ژن- آنتی‌بادی ایجاد شوند و آنتی‌ژن‌های آنزیم مرتبط یا آنتی‌بادی‌ها می‌توانند برای تشخیص و اندازه‌گیری این مجتمع‌ها مورد استفاده قرار گیرند.

برای شناسایی یا اندازه‌گیری آنتی‌بادی در خون شخص، آنتی‌ژن شناخته شده به سطح جامد متصل می‌شود. محلول حاوی نمونه‌ی بیمار اضافه می‌شود. اگر نمونه‌ی بیمار حاوی آنتی‌بادی باشد، به آنتی‌ژن متصل می‌شود. سپس آنتی‌بادی دوم (علیه آنتی‌بادی‌های انسانی) که با آنزیم برچسب گذاری شده است اضافه می‌شود. اگر آنتی‌بادی آنزیم مرتبط با آنتی‌بادی‌های انسانی متصل شود، آنزیم تغییری قابل‌تشخیص ایجاد می‌کند که نشان‌دهنده وجود و مقدار آنتی‌بادی در نمونه بیمار است.

منابع
(© 1994-2006). Introduction to Antibodies – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Millipore Corporation [On-line information]. Available online at http://www.chemicon.com/resource/ANT101/a2C.asp through http://www.chemicon.com.

(2001). Gerostamoulos, J. et. al. (2001). The Use Of Elisa (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Screening In Postmortem Blood. TIAFT, The International Association of Forensic Toxicologists [On-line information]. Available online at http://www.tiaft.org/tiaft2001/lectures/l13_gerostamoulos.doc through http://www.tiaft.org.

Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Harris, N. and Winter, W.

این یک روش آزمایش ایمنی است که پروتئین‌های خاصی را در خون و بافت تشخیص می‌دهد. این روش گام الکتروفورز را با یک گام که پروتئین‌های جدا شده را بر روی غشا انتقال می‌دهد، ترکیب می‌کند. وسترن بلات غالبا به‌عنوان یک آزمایش پیگیری برای تأیید حضور یک آنتی‌بادی و کمک به تشخیص یک بیماری، مورد استفاده قرار می‌گیرد. یک نمونه از آن استفاده از آزمایشات بیماری لایم می‌باشد.

برای انجام آزمایش وسترن‌بلات، نمونه حاوی پروتئین به نقطه‌ای در امتداد انتهای یک لایه ژل اعمال می‌شود. نمونه‌های چندگانه و یک کنترل می‌تواند در کنار یک طرف انتهای ژل در "خطوط" جداگانه قرار گیرد. جریان الکتریکی باعث می‌شود پروتئین‌ها در نمونه (ها) در میان ژل حرکت کنند، پروتئین‌ها را از نظر اندازه و شکل جدا می‌کنند و گروه‌هایی را تشکیل می‌دهند که شبیه به پله‌های نردبان هستند. سپس این نردبان کنترل و نمونه به غشای نازکی که در تماس با ژل قرار دارد منتقل می‌شوند. سپس آنتی‌بادی‌های علامت‌دار یا برچسب‌گذاری شده در فرایندی یک یا دو مرحله‌ای برای تشخیص پروتئین‌های متصل به غشا مورد استفاده قرار می‌گیرند. به‌عنوان مثال، برای تایید HIV یا آزمایشات آنتی‌بادی لایم، پروتئین‌های جداشده ارگانیسم‌های مسبب هستند. سپس نمونه بیمار به لکه اضافه می‌شود و همه آنتی‌بادی‌های ارگانیسم محدود می‌شود و سپس با آنتی‌بادی‌های برچسب شده به ایمونوگلوبولین‌های انسانی شناسایی می‌شود. حضور پروتئین‌های خاص در مقایسه با نمونه‌های کنترل منفی یا مثبت شناخته شده در خطوط دیگر تفسیر می‌شود.

منابع
Khalsa, G. Western blotting. Arizona State University, School of Life Sciences, Mama Ji's Molecular Kitchen [On-line information]. Available online at http://lifesciences.asu.edu/resources/mamajis/western/western.html through http://lifesciences.asu.edu.

Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. Burtis CA and Ashwood ER, Bruns DE, eds. 4th edition St. Louis: Elsevier Saunders; 2006.

این روش تست مولکولی از پروب‌های فلورسنت برای ارزیابی ژن‌ها و یا توالی‌های DNA بر روی کروموزوم‌ها استفاده می‌کند.

انسان‌ها به‌طور معمول 23 جفت کروموزوم دارند: 22 جفت کروموزوم‌های غیرجنسی (اتوزوم) و 1 جفت کروموزوم جنسی (XX برای زنان و XY برای مردان). کروموزوم‌ها از DNA ساخته می‌شوند و توالی‌های چهار پایه را تکرار می‌کنند که هزاران ژن را تشکیل می‌دهند که تولید پروتئین در بدن را هدایت می‌کنند و ویژگی‌های فیزیکی ما را تعیین می‌کنند. DNA شامل دو رشته با هم در یک ساختار دوتایی منحنی حلزونی (مثل یک پله مارپیچ) می‌باشد. هر نیمی از مارپیچ مکمل دیگری است.

برای آزمایش FISH، نمونه‌ای از سلول‌های شخص حاوی DNA به اسلاید شیشه‌ای ثابت می‌شود. نمونه‌ها بسته به علائم بالینی می‌توانند شامل خون، مغز استخوان، مایع آمنیوتیک یا سلول‌های تومور باشند. اسلایدها با DNA "هدف" (شخص) برای جداکردن رشته‌های دوگانه DNA به تک رشته‌ای گرم می‌شوند. سپس پروب‌های فلورسنت به نمونه اضافه می‌شود. پروب‌های فلورسنت بخش‌هایی از DNA تک رشته‌ای هستند که مکمل بخش‌های خاص DNA مورد علاقه هستند. پروب، که با یک رنگ فلورسنت برچسب‌گذاری شده است، به قطعه خاصی از DNA متصل می‌شود. هنگامی که اسلایدها با استفاده از میکروسکوپ ویژه مورد بررسی قرار می‌گیرند، ژن‌هایی که با پروب مطابقت دارند، به‌عنوان مناطق فلورسنت دیده می‌شود که به‌عنوان نقاط روشن در پس‌زمینه تاریک ظاهر می‌شود.

این تکنیک می‌تواند برای نشان دادن حضور کپی‌های ژن اضافی (ژن‌های تکثیرشده یا تقویت‌شده) و توالی‌های ژنتیکی از دست رفته (حذف ژن) یا انتقال یافته (ژن‌های انتقال یافته) استفاده شود. افزایش تعداد کروموزوم‌ها، همانطور که در برخی از اختلالات ژنتیکی دیده می‌شود، با استفاده از فناوری FISH (به‌عنوان مثال تریزومی 21 یا سندرم داون) تشخیص داده می‌شود. محدوده (های) هدف یا توالی DNA توسط پروب‌هایی که مورد استفاده قرار می‌گیرند تعیین می‌شود. مناطق متعدد هدف در DNA را می‌توان همزمان با استفاده از پروب FISH برچسب با تعدادی از رنگ های مختلف فلورسنت مورد ارزیابی قرار گرفت.

عکس‌های زیر سلول‌هایی را نشان می‌دهد که با استفاده از روش FISH ارزیابی شده‌اند. این فقط چند نمونه از استفاده از تکنیک FISH است.

سندرم داون
در شکل 1، آزمایش FISH برای سلول‌های مایع آمنیوتیک اعمال می‌شود که از یک زن باردار منتقل می‌شود که یک نوزاد مشکوک به سندرم داون دارد (تریزومی 21). سه کروموزوم 21 مشاهده می‌شود (سیگنال‌های قرمز). سیگنال‌های سبز (دو نسخه) برای کروموزوم 13؛ این ها برای اهداف کنترل هستند و نشان می‌دهند که آزمایش درست کار می‌کند. FISH از تشخیص بالینی تریزومی 21 پشتیبانی می‌کند. پزشکان و مشاوران ژنتیک با این زن کار خواهند کرد تا نتایج حاصل از آزمایش آن را درک کنند.

شکل 1: یک سلول از مایع آمنیوتیک که (برای trisomy 21 توسط FISH مثبت است) سیگنال‌های قرمز
Mary Lowery Nordberg، PhD با احترام

 

سرطان پستان
در شکل 2، FISH برای ارزیابی سلول‌های تومور پستان برای حضور یک ژن تقویت شده HER-2/neu (سیگنال‌های قرمز) استفاده می‌شود. در حدود 25٪ از سرطان‌های پستان، HER-2/neu تقویت می‌شود. زنان با تومورهای HER-2/neu تقویت‌شده با یک داروی (هرسپتین ) که پروتئینی که محصول ژن غیرطبیعی را هدف قرار می‌دهند، درمان می‌شوند. زن با تومور HER-2 / neu تقویت‌شده، به احتمال زیاد هیچ مزایای درمانی از هرسپتین درمانی دریافت نمی‌کند و سایر داروها در نظر گرفته می‌شود.

 

شکل 2: سلول‌های تومور پستان مثبت برای Her2 / neu
تقویت (سیگنال قرمز چندگانه). سیگنال‌های سبز
پروب‌های کنترل که نشان می‌دهد تست به‌درستی انجام شده است.
با احترام Mary Lowery Nordberg, PhD

 

لوسمی
شکل 3 نشان می‌دهد FISH در نوع خاصی از لوسمی مزمن، لوسمی مزمن میلوئیدی (CML) استفاده می‌شود. پروب‌های خاص مورد استفاده در این مورد، BCR-ABL را تشخیص می‌دهد، یک توالی ژن غیرطبیعی ایجاد شده توسط انتقال یک بخش از کروموزوم 22 (BCR، یک پروب سبز) با بخشی از کروموزوم 9 (ABL1، پروب قرمز) است. مناطق فلورسانت زرد، نشان‌دهنده غیرطبیعی بودن، همجوشی (اتصال پروب‌های قرمز و سبز) است. یافتن فیوژن BCR-ABL تشخیص CML را تایید می‌کند. بیماران BCR-ABL مثبت از داروهای هدفمند مولکولی مانند ایاتینیب بهره‌مند می‌شوند.

شکل 3: سلول BCR-ABL مثبت باFISH (سیگنال فیوژن زرد). سیگنال زرد همجوشی پروب سبز را نشان می‌دهد (BCR بخشی از کروموزوم 22) با پروب قرمز (بخش ABL1 از کروموزوم 9).
با احترام Mary Lowery Nordberg، PhD

 

منابع

(August 16, 2010) Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). National Human Genome Research Institute [On-line information]. Available online at http://www.genome.gov/10000206 through http://www.genome.gov. Accessed March 2011.

(August 16, 2010) Frequently Asked Questions about Genetic Testing. National Human Genome Research Institute [On-line information].Available online at http://www.genome.gov/19516567 through http://www.genome.gov. Accessed March 2011.

(March 6, 2006) Genetics Home Reference. Fluorescent in situ hybridization. Available online at http://ghr.nlm.nih.gov/glossary=fluorescentinsituhybridization through http://ghr.nlm.nih.gov. Accessed March 2011.

(June 29, 2011) Hiller B, Bradtke J, Balz H and Rieder H (2004). CyDAS Online Analysis Site. Available online at http://www.cydas.org/OnlineAnalysis/ through http://www.cydas.org. Accessed July 2011. 

PCR یک روش آزمایشگاهی است که برای ساخت تعداد زیادی نسخه از مقادیر کوتاه DNA از یک نمونه بسیار کوچک از مواد ژنتیکی استفاده می‌شود. این فرایند "تقویت" DNA است و آن را قادر می سازد ژن‌های خاص مورد علاقه برای شناسایی و یا اندازه‌گیری.

DNA از تکرار توالی‌های چهار پایه - آدنین، تیمین، گوانین و سیتوزین تشکیل شده است. این توالی‌ها دو رشته تشکیل می‌دهند که در ساختار دو مارپیجی با پیوندهای هیدروژنی (مثل پله مارپیچی) با یکدیگر مرتبط می‌شوند. هر نیمی از مارپیچ مکمل دیگری است. در انسان، این تفاوت در توالی این پایه‌ها در هر رشته DNA است که منجر به آرایش منحصر به‌فرد ژنتیکی هر شخص می‌شود. آرایش پایه‌ها در هر ژن برای تولید RNA مورد استفاده قرار می‌گیرد که به‌نوبه خود پروتئین تولید می‌کند. در ژنوم انسان حدود 25000 ژن وجود دارد و تجلی این ژن‌ها به تولید تعداد زیادی پروتئین منجر می‌شود که بدن ما را تشکیل می‌دهند. DNA دیگر موجودات زنده مانند باکتری‌ها و ویروس‌ها نیز شامل هزاران ژن مختلف است که پروتئین آنها را کدگذاری می‌کند.

روش انجام چگونه است؟
PCR در چند مرحله یا "چرخه" در یک وسیله به نام ترموسایکلر انجام می‌شود. این دستگاه دمای نمونه را در فواصل مشخص شده در طی مراحل افزایش و کاهش می‌دهد.

1. اولین مرحله یا چرخه PCR، با افزایش دمای نمونه‌ای که حاوی DNA مورد علاقه است رشته‌های DNA را به دو رشته‌ی مجزا جدا می‌کند. این مرحله "تقلیب"(دگرگون‌کردن) DNA نامیده می‌شود.
2. هنگامی که رشته‌ها جدا شوند، نمونه کمی خنک می‌شود و پرایمری جلو و معکوس اضافه می‌شوند و امکان اتصال به رشته‌های تک‌رشته‌ای DNA را فراهم می‌کنند. پرایمر توالی‌های کوتاهی از پایه‌های ساخته‌شده به‌طور خاص برای تشخیص و اتصال به بخشی از DNA به‌منظور تقویت است، که توالی بسیار خاص از پایه‌هایی است که بخشی از ژن و یا ژن‌های مورد علاقه است. پرایمر با توجه به جهتی که پایه‌ها در داخل بخش DNA کپی می‌شوند"جلو" و "معکوس" نامیده می‌شوند.
3. پس از اینکه دو پرایمر به هر رشته DNA متصل شد، یک آنزیم DNA (اغلب تک پلیمراز ) سپس نسخه‌های توالی DNA را در هر نیمی از مارپیچ از جلو به پرایمر معکوس کپی می‌کند و دو بخش دورشته‌ای DNA را تشکیل می‌دهد. با یک نیمه اصلی و یک نیمه جدید. تک پلیمراز آنزیمی است که در یک باکتری یافت می‌شود (ترموس آکواتیکوس) که در آب بسیار گرم، مانند چشمه جوشان آب گرم و معدنی یا چشمه‌های داغ رشد می‌کند. پلایمراز DNA (یا RNA) را برای ایجاد رشته‌های جدید کپی می‌کند. تک پلیمراز مخصوصا آزمایشات آزمایشگاهی بسیار مفید است زیرا (برخلاف بسیاری از آنزیم‌های دیگر) در دماهای بسیار بالای مورد نیاز برای انجام PCR شکسته نمی‌شود.
4. هنگامی که حرارت دوباره اعمال می‌شود، هر دو رشته‌ی دورشته‌ای برای ایجاد چهار رشته تک جدا می‌شوند، و در هنگام سرد شدن، پرایمر و پلیمراز برای ایجاد چهار بخش دورشته‌ای عمل می‌کنند. چهار رشته در چرخه بعدی هشت، هشت تبدیل به شانزده، و اینچنین ادامه می‌یابد.
5. طی 30 تا 40 دوره، می‌توان تعداد زیادی از یک میلیارد نسخه از بخش اصلی DNA تولید کرد و سپس در آزمایش‌های تشخیصی مولکولی مورد استفاده قرار می‌گیرد. این فرآیند به‌صورت خودکار انجام شده است، به‌طوری که یک میلیارد نسخه DNA اصلی می‌تواند ظرف چند ساعت تولید شود.

 

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز. اعتبار عکس: Darryl Leja، موسسه تحقیقاتی ژنوم انسانی

 

این آزمایش در چه مواردی کاربرد دارد؟
برای مثال می‌توان از این روش برای شناسایی ژن‌های خاصی در DNA شخص استفاده کرد، مانند آنهایی که در ارتباط با سرطان یا اختلالات ژنتیکی هستند، یا می‌تواند برای تشخیص مواد ژنتیکی باکتری‌ها یا ویروس‌هایی که باعث عفونت می‌شوند استفاده شود.

 این فقط چند نمونه از آزمایشات آزمایشگاهی است که از PCR استفاده می‌کنند:

• JAK2
• KRAS
• بیماری لایم
• سیاه‌سرفه
• HPV
• CMV
• سوزاک
• کلامیدیا
• انگشت‌نگاری با DNA
• نظارت بر پیوند

 PCR زمان واقعی مشابه با PCR است، به‌جز اینکه داده‌ها به‌عنوان فرآیند تقویت در حال انجام است (به‌عنوان مثال، "زمان واقعی") به‌جای یک نقطه پایانی معین شده و زمان آزمایش را از یک شب تا چندساعت کوتاه می‌کند. این روش برای اندازه‌گیری مقدار DNA موجود در نمونه استفاده می‌شود.

RT-PCR (PCR رونویسی معکوس)
این روش از PCR برای تقویت RNA استفاده می‌کند. RNA مولکول اسیدنوکلئیک تک‌هسته‌ای است و قبل از اینکه بتوان آن را تقویت کرد، باید به DNA تبدیل شود. اضافه کردن یک رشته جدید که مکمل RNA است توسط آنزیمی به‌نام ترانزیستور معکوس (RT) و پرایمر ضدانسداد (معکوس) به‌دست آمده است. پرایمر به RNA تک‌رشته متصل می‌شود و آنزیم RT یک رشته RNA را برای ساخت یک DNA تک‌رشته‌ای کپی می‌کند که برای ساخت مولکول DNA دورشته‌ای کپی می‌شود. مولکول دورشته‌ای اکنون می‌تواند توسط PCR تقویت شود. تشخیص همچنین می‌تواند با روش‌های زمان واقعی باشد.

 در اینجا دو نمونه از آزمایشات آزمایشگاهی است که از RT-PCR استفاده می‌کنند آورده شده است:

• بار ویروسی HIV
• HCV

منابع

(February 27, 2012). Polymerase Chain Reaction (PCR). National Human Genome Research Institute [On-line information]. Available online at http://www.genome.gov/10000207 through http://www.genome.gov. Accessed August 2012.

Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, eds. St. Louis: Elsevier Saunders; Fifth edition, 2011, Pp 1412-1413.

Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Pp 135-137.